Asombrosos avances en el desarrollo de nuevas y más efectivas terapias se han logrado debido a la aplicación de tecnologías basadas en ADN recombinante y cultivos celulares. Las sofisticadas moléculas desarrolladas, basadas principalmente en proteínas recombinantes (biofarmacéuticos), han revolucionado los tratamientos de enfermedades como el cáncer o las enfermedades autoinmunes crónicas. Esto, junto con un aumento de la aprobación para usos clínicos por parte de organizaciones internacionales en Europa y EE. UU. (siendo 2018 un año récord para las aprobaciones de nuevas entidades moleculares), ha provocado un crecimiento sustancial en la fabricación biofarmacéutica en los últimos 15 años. Se prevé que este crecimiento continúe desde un valor de mercado de 251 800 millones de USD en 2017 a 580 500 millones de USD en 2026, lo que representa un factor de crecimiento anual compuesto del 13 % y un sector económico clave.
Los anticuerpos monoclonales recombinantes (MAbs) son el grupo de biofármacos de mayor crecimiento de la industria farmacéutica, con más de 200 productos comercializados y cientos más en desarrollo, utilizados en el tratamiento de diversas enfermedades entre ellas cáncer y enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Todo ello debido a su alta especificidad, baja toxicidad, farmacocinética predecible y/o alta demanda de dosis.
Los MAbs son glucoproteínas bifuncionales constituidos por cuatro cadenas polipeptídicas formando una estructura en forma de Y, donde en el extremo amino (región Fab) se une específicamente al blanco y el extremo carboxi (región Fc) da forma a la región de unión a células y moléculas del sistema inmune cumpliendo funciones efectoras. A pesar de grandes avances científicos y tecnológicos aún resta mucho para mejorar la farmacocinética, farmacodinamia y rendimientos de producción de estos medicamentos, los que tienen que ver con la unión de los dominios Fab a sus blancos, Fc a los receptores FcR, neonatal (FcRn) y molécula C1q del sistema del complemento. Diversos cambios a nivel estructural del MAb pueden afectar sus cualidades. Por ejemplo, distintas fracciones glicosiladas de un MAb presentan características diferentes de afinidad por FcRn, FcyR y estabilidad. De esta forma, modificaciones estructurales de MAbs mediante diseños bioinformáticos, optimización de procesos productivos y de entrega conducirán a MAbs que exhiben mejores propiedades.
Producción de anticuerpos monoclonales en células CHO
Los productos biofarmacéuticos comercialmente relevantes se fabrican principalmente en líneas celulares de mamíferos recombinantes, dado que estos hospederos disponen de la maquinaria metabólica y postraduccional requerida para la correcta síntesis de este tipo de moléculas. Cabe destacar, que las células de ovario de hámster chino (CHO) son, con diferencia, la plataforma de expresión más utilizada (Ej. 84 % de los mAbs aprobados entre 2015 y 2018 se producen en células CHO).
Las células CHO presentan varias ventajas claves sobre otros tipos de células para la producción de proteínas recombinantes. Esto incluye (i) capacidad de realizar modificaciones postraduccionales complejas (PTM), como glicosilaciones de tipo ‘humano’, procesamiento adecuado de proteínas (por ejemplo, fosforilación) y plegamiento, (ii) un robusto crecimiento en cultivo en suspensión, sin requerimientos de suero, lo que facilita el proceso de propagación y expansión de células, (iii) una validación como hospedero seguro con una alta tasa de aprobación regulatoria y (iv) sistemas de transfección/selección optimizados que permiten una introducción relativamente simple y la expresión estable de genes heterólogos.
Este último punto es clave en el dominio del sistema basado en células CHO, dado que permite que los genes de interés (GOI) se expresen de manera estable, con los niveles de producción y calidad requeridos para su uso biofarmacéutico.
Desafíos en la tecnología de producción de mAbs en células CHO
No obstante los importantes avances logrados en los últimos 35 años, luego de la aprobación por parte de la FDA del 1º biofarmaco producido en células mamíferas CHO, aun los procesos productivos en que se utilizan células CHO presentan una serie de inconvenientes. En particular, estas células tienen bajas tasas de secreción de algunas proteínas recombinantes, lo que impacta negativamente en la productividad en procesos de producción a gran escala. Junto con esto, los procesos basados en células CHO son muy costosos, tanto para la fabricación de los productos biofarmacéuticos (es decir, materiales, mano de obra e instalaciones) como para obtener la aprobación de las agencias regulatorias (FDA, EMA, entre otras), que incluye pruebas de la consistencia del proceso productivo, producción de un producto bioactivo eficaz, seguro y libre de contaminantes (asociados al proceso y al producto). Por lo tanto, se necesitan grandes esfuerzos en la optimización de la fabricación en células CHO para superar las bajas productividades en la proteína de interés, reducir los costos de fabricación y aumentar la accesibilidad de este tipo de medicamentos que cambian sustancialmente la calidad de vida de los pacientes.
El paradigma de los productos biológicos “el proceso es el producto” resulta altamente pertinente en el ámbito de los biofarmacos y de los MAbs en particular. Para que un potencial candidato de MAb pase de la fase de descubrimiento (Etapa 1) a un programa de desarrollo clínico (Etapa 2), se debe disponer de un acabado diseño y producción del MAb y de una detallada caracterización de atributos de calidad (bioquímicos y físico-químicos) y su impacto en términos de la funcionalidad, disponibilidad y estabilidad del MAb en las distintas sub-etapas de la fase de descubrimiento. Es importante comprender a fondo las características del producto y el proceso a escala de banco para facilitar la transferencia (tecnológica) de todos los parámetros críticos hacia la Etapa 2. En países desarrollados, la Etapa 1 usualmente es desarrollada en la academia bajo esquemas de colaboración multidisciplinaria altamente integrados y que incorporan en el desarrollo las mejores prácticas del entorno industrial. Por su parte, la etapa 2, que supone el mayor tiempo y costo de desarrollo, es asumida por la industria.
En la medida que nuestro sistema universitario comienza a centrarse en la comercialización de la investigación, se requiere que los distintos actores involucrados en el descubrimiento de eventuales MAbs interactúen tempranamente para pasar de la investigación al proceso de innovación de forma efectiva.
Experiencia y propuesta de investigación para la producción de mAbs en células CHO
El grupo de investigación de la Dra. Claudia Altamirano y el Dr. Julio Berrios ha centrado su trabajo en las mejoras de los cultivos de células de mamíferos para la producción de productos biofarmacéuticos. Su experiencia de más de 20 años en el área, se basa en la evaluación de diferentes condiciones ambientales de cultivo, tanto en el nivel de formulación del medio de cultivo como de condiciones operacionales (por ejemplo, hipotermia leve), sobre la producción de biofarmacéuticos. Este trabajo lo han complementa con el uso de herramientas de biología de sistemas que incluyen transcriptómica, metabolómica y el desarrollo de modelos metabólicos a escala genómica para la predicción de condiciones de producción optimizadas.
En este marco nuestro grupo de investigación se planteo Estudiar el impacto de los parámetros críticos del proceso (CPPs) de cultivo en la cinética de producción, afinidad al blanco terapéutico, afinidad FcyR / FcRn, mecanismo de acción (MoA) y variantes glicosiladas de anticuerpos monoclonales recombinantes completamente humanos producidos en cultivo de células CHO.
El diseño basado en la calidad (QbD) para el desarrollo de MAbs consiste en especificar de manera temprana los parámetros de calidad del producto (QPP) (eficacia, potencia, estabilidad y seguridad), su relación con los atributos críticos de calidad (CQA) y los parámetros de fabricación. Tanto el nivel de producción como los QPP son muy sensibles a las condiciones operativas del proceso de producción. Ligeras variaciones o cambios en parámetros críticos del proceso (CPP), como la temperatura y el pH, pueden provocar cambios no deseados en el producto entre las diferentes fases del desarrollo biofarmacéutico (descubrimiento, preclínica, clínica I-IV) y luego entre los lotes de producción. Por lo tanto, la complejidad de su proceso productivo implica identificar los CPP desde las etapas iniciales de desarrollo productivo, para asegurar los CQA y consecuentemente los QPP.
Los CQA se clasifican en aquellos asociados al proceso (Ej. nivel de endotoxina, lixivaidos, virus, ect) y los asociados al producto (variantes de tamaño, carga, glicosilación, etc). Los distintos CQA pueden afectar de forma independiente o conjunta a los distintos parámetros de calidad definidos para los MAbs. Por lo tanto, se debe realizar una caracterización físico-química y bioquímica detallada de los MAb para evaluar sus CQA y el impacto en sus parámetros de calidad.
Como se ha indicado, la producción de MAbs se lleva a cabo en células CHO, utilizando cultivos en suspensión en biorreactores de tanque agitado operados bajo diferentes modalidades (batch, fed-batch o perfusión). El cultivo batch se usa ampliamente en las fases iniciales del desarrollo de MAbs, para establecer CPP que impactan en CQA y QPP, y son esenciales para diseñar e implementar con éxito cultivos productivos de alta densidad (fed-batch o perfusión) y su posterior escalamiento.
El bioproceso basado en células CHO es afectado por diversos factores, dependientes tanto de las características de la línea celular como de las condiciones de operación. Además, la expresión del gen recombinante dependerá del diseño de la construcción del plásmido. Por su parte, es fundamental considerar la expresión estable del MAbs de interés. Por lo tanto, la inclusión de promotores potentes, de estabilización del RNAm, de secuencias de inicio de la traducción, entre otras, se constituyen en estrategias de optimización del vector de expresión del MAbs de interés.
Para generar clones estables y altamente productivos, se requiere una estrategia de clonación adecuada. La técnica de intercambio de casetes mediada por recombinasa (RMCE) se usa con frecuencia para la transfección estable de células de mamíferos, lo que permite el uso de sitios genómicos previamente caracterizados con un alto nivel de expresión, lo que facilita una selección de alto rendimiento, clones estables y una reducción drástica del tiempo de desarrollo. Sin embargo, para utilizar la técnica RMCE se necesitan cepas competentes. En colaboración con el Dr. Dagnar Wirth de HZI (Alemania), nuestro grupo implementó esta tecnología para la expresión estable de varias proteínas recombinantes en células CHO (FONDECYT 1161452 y 1200962).
Para lograr un progreso sólido en el desarrollo de MAbs, es esencial tener una comprensión profunda de las relaciones entre los parámetros del proceso, los atributos de calidad (QA) y los parámetros de calidad del producto (QPP) en cada etapa del proceso de producción. Asimismo, el establecimiento de estas relaciones servirá para retroalimentar de forma integral el desarrollo de MAbs, desde los modelos bioinformáticos utilizados para el diseño de MAbs con características mejoradas; técnicas de caracterización de MAbs (Ej. identificación de un nuevo CQA); hasta afinar el diseño experimental (DoE) optimizando la producción de MAbs.
Un CPP representa una variable característica del sistema que tiene un efecto significativo en un CQA y, por lo tanto, debe monitorearse y controlarse para garantizar que el producto, en este caso un MAb, posee los QPP deseados. La medición de los parámetros de calidad en la fabricación y la producción comienza con el control de varios parámetros comunes del proceso, incluidos los CPP potenciales que afectan los CQA, y se considera la caracterización del producto y la literatura científica para determinar los CQA. Los experimentos de caracterización del proceso generalmente se realizan utilizando DoE para evaluar los efectos principales de los parámetros y sus interacciones, y los CPP potenciales en la etapa de cultivo son la temperatura, el pH y la concentración de oxígeno disuelto.
En la producción de proteínas recombinantes a escala de biorreactor, los CPP tienen un impacto no solo en la viabilidad y productividad celular, sino también en la estructura de las glicosilaciones. Dado que el proceso de glicosilación de proteínas en la célula es el resultado de una interacción compleja de varias enzimas en el ER y Golgi, la forma en que los CPP lo afectan es difícil de predecir y controlar. Sin embargo, existen varios estudios que han establecido una relación entre variables de proceso como temperatura de cultivo, pH y tensión de oxígeno disuelto (DOT) y estructura y funcionalidad de MAb. Variables de proceso que serán estudiadas para el logro de nuestro objetivo.
